Western blot analysis of mitochondr

Western blot analysis of mitochondrial proteins
For western blots, equal amounts of total cellular proteins
(10–20 mg) were separated on a 13% SDS–polyacrylamide
gel and transferred onto nitrocellulose membrane.
Membranes were then blocked with 5% nonfat milk in
0.1% TBS–Tween-20 and probed with specific antibodies
against mitochondrial-encoded subunit I (COXI gene,
Molecular Probes, Eugene, OR, USA) and 20 kDa subunit
(MTND6 gene, Molecular Probes) and against nuclearencoded
subunit IV (COXIV, Molecular Probes) and
39 kDa subunit (NDUFA9 gene, Molecular Probes) of
respiratory complex I and complex IV, respectively.
Membranes were also probed with specific antibodies
against actin (from Sigma) utilized as loading control.
Membranes were finally incubated with HRP-conjugated
secondary antibodies and developed with a chemiluminescent
reagent (NEN). The bands were quantified with a
VersaDoc 1000 Imaging System using the Quantity One
software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Isolation of genomic DNA
Genomic DNA was isolated from cells by a proteinase K/
SDS treatment and phenol/chloroform extraction according
to standard procedures (14). Total DNA was extracted
from cell cultures by IsoQuick Nucleic Acid Extraction kit
(ORCA Research, Inc., Bothell, WA, USA) according to
manufacturer’s procedures.

Результаты (русский) 1:

Западный анализ помаркой митохондриальных белков
для западных помарок, равное количество суммарных клеточных белков
(10 – 20 мг) были разделены на 13% SDS-Полиакриламида
гель и переносится на нитроцеллюлозную мембрану.
мембраны затем были прегражены с 5% обезжиренное молоко in
0.1% TBS-Tween-20 и исследован с специфическими антителами
против митохондрий закодированы субъединицы I (COXI гена,
молекулярных зондов, Eugene, ИЛИ США) и 20 кДа субъединицы
(MTND6 ген, Molecular Probes ®) и против nuclearencoded
субъединицы IV (COXIV, Molecular Probes ®) и
39 кДа субъединицы (ген NDUFA9, Molecular Probes ®)
дыхательных комплекса I и IV комплекс, соответственно.
мембраны также были зондируемой с специфическими антителами
против актина (от Сигма) используются в качестве загрузки элемента управления.
мембраны наконец инкубировали с конъюгированных ПХ
вторичные антитела и разработан с хемилюминесцентный
реагента (NEN). Полосы были количественно с
VersaDoc 1000 изображений системы, с помощью количества один
программное обеспечение (Bio-Rad лабораторий, Геркулес, Калифорния, США).
выделение геномной ДНК
геномной ДНК был изолирован от клеток протеиназы K /
SDS лечение и фенол/хлороформ извлечения согласно
для стандартных процедур (14). Всего ДНК было извлечено
из клеточных культур, экстракция нуклеиновых кислот IsoQuick комплект
(ORCA Research, Inc., Bothell, Вашингтон, США) согласно
процедурах изготовителя.

Результаты (русский) 2:

Вестерн-блот анализ митохондриальных белков
для Западной пятнами, равных количеств общего клеточного белка
(10-20 мг) разделяли на 13% SDS-полиакриламидном
геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану.
Затем мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в
0,1% TBS-Твин-20 и зондировали специфических антител
против митохондриальной кодировке субъединицы I (гена COXI,
Molecular Probes, Eugene, OR, США) и 20 кДа субъединицы
(ген MTND6, Molecular Probes) и против nuclearencoded
субъединицы IV (COXIV, Molecular Probes ) и
39 кДа субъединицы (генных NDUFA9, Molecular Probes) из
сложного дыхательных I и сложной IV, соответственно.
Мембраны также зондируют специфических антител
против актина (от фирмы Sigma), используемые в качестве контроля загрузки.
Мембраны инкубировали в конечном счете с HRP-конъюгированных
вторичных антител и разработана с хемилюминесцентным
реагента (СЭС). Полосы были количественно с
VersaDoc 1000 Imaging System с использованием Количество One
программное обеспечение (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Выделение геномной ДНК
геномной ДНК была выделена из клеток с помощью протеиназы К /
лечения SDS и экстракции фенолом / хлороформом в соответствии
со стандартными процедурами (14). Всего ДНК экстрагировали
из клеточных культур на IsoQuick нуклеиновых кислот Extraction комплекте
(ORCA Research, Inc, Bothell, WA, США) в соответствии с
процедурами изготовителя.

Результаты (русский) 3:

Западной пятном анализа митохондрий белки
для западной hopen, равные суммы общего сотовые белки
10-20 мг) были разделены на 13% SDS-услуги / ХИМИКАТЫ / Полиакриламид гель $и переносится на нитроцеллюлозные мембраны.
мембраны были заблокированы с 5% описание продукции молоко в
0,1 % от веса TBS-... шоссе Ай-20 и объединиться с специфических антител против $митохондрий-кодированного подгруппе I (COXI гена,
молекулярной зонды, Юджин,Или, США) и 20 Као томографией
(MTND6 гена, молекулярной датчики) и против nuclearencoded
томографией IV (COXIV, молекулярная датчики) и
39 Као томографией (NDUFA9 гена, молекулярной зонды)
дыхательных сложных я и сложных IV, соответственно.
мембраны были также объединиться с специфических антител
против актиновый цитоскелет (сигма) используются в качестве загрузка.
мембраны были наконец побежден без установления мира с HRP-плесень
Или, США) и 20 Као томографией
(MTND6 гена, молекулярной датчики) и против nuclearencoded
томографией IV (COXIV, молекулярная датчики) и
39 Као томографией (NDUFA9 гена, молекулярной зонды)
дыхательных сложных я и сложных IV, соответственно.
мембраны были также объединиться с специфических антител
против актиновый цитоскелет (сигма) используются в качестве загрузка.
мембраны были наконец побежден без установления мира с HRP-плесень
Общее количество ДНК был извлечен
из клетки, IsoQuick нуклеиновых кислот набор для снятия
(стаек, Inc. , Эверет", WA, USA) в соответствии с
изготовителем процедуры.Вторичные антитела и разработана с использованием хемилюминесцентных
реагента (nen). Банды были определены количественно с
VersaDoc 1000 система для визуализации с помощью количество One
программное обеспечение (BIO-RAD лабораторий, геркулес, Калифорния, США) .
изоляции геномной ДНК
геномной ДНК был изолирован от клеток в proteinase K/
SDS обращения и фенол/холодильные технологии добычи в соответствии
стандартные процедуры 14).