Junctions of the four iPS-1 inserti

Junctions of the four iPS-1 insertion sites and the three
iPS-2 insertion sites were cloned by inverse PCR and
sequenced [32, 33]. Table 1 lists the locations of these sites.
Three of the iPS-1 insertion sites are within introns, and one
is located in an intergenic region that is 2 Mb downstream of
the transcription start site (TSS) of the NMBr gene and 1 Mb
upstream of the TSS of the Cited2 gene. All three iPS-2 insertions
are located in introns. These results demonstrate that iPS
cells can be readily obtained by this procedure without interruption of coding sequences, promoters, or known regulatory
elements. Cloning and sequencing of the insertion sites
from iPS-1 Cre cells demonstrated that only the 291-bp 30
LTR of the polycistronic vector remains in the genome. This
small SIN LTR does not contain a promoter or enhancer;
therefore, the probability of insertional activation or inactivation
of endogenous genes is low.
Figure 2 demonstrates that iPS-1 Cre cells continue to
stain positive for alkaline phosphatase, Nanog, and SSEA1 after
OSK deletion, and Figure 3 demonstrates that expression
of endogenous Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, and Cripto was
maintained in the absence of OSK expression. As expected,
the endogenous Oct4 and Nanog promoters remained hypomethylated
after OSK deletion (Fig. 3B and 3C).
Finally, two iPS-1 Cre cell lines were injected into wildtype
blastocysts, and these blastocysts were transferred into
the uteri of pseudopregnant female mice. After 2 weeks,
embryos were analyzed for chimerism by PCR with primers
specific for human and mouse b-globin genes. Figure 5B
demonstrates that several high-level chimeras were obtained;
most tissues of these embryos were derived from iPS-1 Cre
cells which contain only human b-globin genes. One pregnancy
was allowed to proceed to term, and Figure 5C shows
an adult high-level chimera (right) derived from iPS-1 Cre 2
cells. These results strongly suggest that adult skin fibroblasts
can be effectively reprogrammed to iPS cells with our ‘‘hit
and run’’ polycistronic lentiviral vector and that tissues from
all three germ layers can be derived from these cells.

Результаты (русский) 1:

Стыки четырех сайтов вставки iPS-1 и триiPS-2 вставки сайты были клонированы по обратное PCR иВиртуализированный [32, 33]. В таблице 1 перечислены расположения этих сайтов.Три из iPS-1 вставки сайты находятся в пределах интронов и одинрасположен в intergenic регионе, это 2 МБ по течениюТранскрипция стартовый сайт (TSS) гена NMBr и 1 Mbвверх по течению от TSS гена Cited2. Все три вставки iPS-2расположены в интронов. Эти результаты показывают, что iPSклетки могут быть легко получены путем этой процедуры без перерыва кодирования последовательностей, промоутеров или известный регулированияэлементы. Клонирование и секвенирование вставки сайтовот Cre iPS-1 клетки продемонстрировали, что только 30 291-ВРLTR полицистронная вектора остается в геноме. Этонебольшой ГРЕХ LTR не содержит промоутер или усилитель;Таким образом вероятность инсерционному активации или дезактивацииэндогенные генов является низким.Рисунок 2 показывает, что iPS-1 Cre клетки продолжаютпятно позитивные щелочной фосфатазы, Nanog и SSEA1 послеОСК удаления и на рисунке 3 показано выражениеэндогенные Oct4 Sox2, Klf4, Nanog и Cripto былподдерживается в отсутствие экспрессии ОСК. Как и ожидалось,эндогенные Oct4 и Nanog промоутеров оставался hypomethylatedПосле удаления ОСК (рис. 3B и 3C).Наконец две линии клетки Cre iPS-1 были введены в wildtypeбластоцисты и эти бластоцисты были переведены вматки pseudopregnant самок мышей. После 2 недель,Эмбрионы были проанализированы для химеризма методом ПЦР с праймерамиспецифические для человека и мыши b глобина генов. Рисунок 5Bпоказывает, что были получены несколько высокого уровня химер;большинство тканей этих эмбрионов были получены от Cre iPS-1ячейки, которые содержат только b глобина человека генов. Одна беременностьбыло разрешено приступить к перспективе и показывает рисунок 5 cВзрослый высокого уровня Химера (справа), полученных от Cre iPS-1 2клетки. Эти результаты сильно предлагаю что взрослые фибробласты кожиможно эффективно перепрограммировать клетки iPS с нашими '' хити запустить '' полицистронная лентивирусные вектор и что тканей отвсе три зародышевых могут быть получены от этих клеток.

Результаты (русский) 2:

Спаи четырех ИПС-1 вставных участков и трех
ИПС-2 вставные участки были клонированы с помощью обратной ПЦР и
секвенированы [32, 33]. В таблице 1 приведены расположение этих сайтов.
Три из ИПС-1 вставки сайты находятся в пределах интронов, и один
находится в межгенном регионе , который составляет 2 Мб ниже
сайта инициации транскрипции (TSS) гена NMBR и 1 Мб
вверх по течению ОТЧ гена Cited2. Все три ИПС-2 Вставки
расположены в интронов. Эти результаты показывают , что плюрипотентных
клетки могут быть легко получены с помощью этой процедуры без перерыва кодирующих последовательностей, промоторов, или известных регуляторных
элементов. Клонирование и секвенирование вставки сайтов
из ИПС-1 Cre клеток показали , что только 291 пар оснований 30
ДКП из полицистронного вектора остается в геноме. Этот
маленький СИН ДКП не содержит промотор или энхансер,
следовательно, вероятность инсерционной активации или инактивации
эндогенных генов низка.
Рисунок 2 показывает , что ИПС-1 Cre клетки продолжают
окрашивает положительными для щелочной фосфатазы, Nanog и SSEA1 после
OSK удаление, а на рисунке 3 показано , что экспрессия
эндогенных Oct4, Sox2, Klf4, Nanog и криптоармянина был
поддерживается в отсутствие экспрессии OSK. Как и ожидалось,
эндогенные Oct4 и Nanog промоторы оставались hypomethylated
после OSK удаления (рис. 3В и 3С). И,
наконец, два ИПС-1 клеточные линии Cre вводили в дикого типа
бластоцист, и эти бластоцисты переносили в
матках ложнобеременных самок мышей. После 2 -х недель,
эмбрионы были проанализированы на химеризму с помощью ПЦР с использованием праймеров ,
специфичных для B-глобина генов человека и мыши. Рисунок 5B
показывает , что несколько химеры высокого уровня были получены,
большинство тканей этих эмбрионов были получены из ИПС-1 Cre
клеток , которые содержат B-глобина гены только человека. Одна беременность
протекала в перспективе, а на рисунке 5С показывает
взрослый на высоком уровне химеру (справа) , полученные из ИПС-1 Cre 2
клеток. Эти результаты убедительно показывают , что фибробласты кожи взрослого
может быть эффективно перепрограммировать в плюрипотентных клеток с нашими '' хит
и запустить '' полицистронная лентивирусов вектор и что ткани из
всех трех зародышевых листков могут быть получены из этих клеток.