Direct reprogramming of adult somat

Direct reprogramming of adult somatic cells to pluripotent
stem cells has tremendous therapeutic potential. We recently
demonstrated that adult skin fibroblasts from our humanized
sickle mice can be reprogrammed into iPS cells and that the
sickle mutation can be corrected in these cells by gene
replacement. Hematopoietic progenitors derived from corrected
iPS cells were transplanted into irradiated sickle mouse
recipients, which corrected the severe anemia and organ pathology
that characterize sickle cell disease in humans [2].
Although these results provided a foundation for a similar
approach in humans, the reprogramming vectors that we used
previously cannot be employed in human cells that will ultimately
be used for therapy. Therefore, we developed and
tested a single, polycistronic lentiviral vector that can be
deleted after reprogramming adult fibroblasts into iPS cells.
Porcine teschovirus-1 2A sequences that trigger ribosome
skipping were inserted between human Oct4, Sox2, and Klf4
cDNAs, and the polycistron was subcloned downstream of an
EF-1a promoter in a SIN lentiviral vector containing a loxP
site in the truncated 30 LTR. The 2A peptide CHYSEL sequences
signal the ribosome to skip formation of a peptide linkage
between a glycine and a proline during translation and produce
Oct4 and Sox2 proteins containing additional 21 amino acids
at the carboxy termini (supporting information Fig. 1). A single
proline is also appended to the amino termini of Sox2 and
Klf4. Our results demonstrate that Oct4, Sox2, and Klf4 with
these terminal modifications are fully capable of reprogramming
adult skin fibroblast into iPS cells. Both transient Cre
expression from a plasmid and Adeno/Cre infection of iPS
cells effectively deleted the OSK polycistronic lentival vector.
Importantly, after OSK deletion and injection into NOD/
SCIDIL2R/ mice, individual clones of iPS cells were capable
of forming tissues derived from all three germ layers.
These tissues included endoderm-derived intestine epithelium,
ciliated respiratory epithelium and pancreatic acini, mesoderm-
derived skeletal muscle, cartilage and bone, and ectoderm-
derived nervous tissue and skin-like stratified squamous
epithelium. Furthermore, after lenti/OSK deletion, high-level
chimeric embryos and adults were obtained when iPS cells
were injected into wild-type blastocysts.
Yamanaka’s group recently reported that a similar polycistronic
vector containing foot and mouth disease virus 2A peptides
could reprogram MEFs to iPS cells [17]. In these experiments, an
OKS polycistronic plasmid was transiently cotransfected with a c-
Myc plasmid into MEFs, and these embryonic cells were successfully
reprogrammed into iPS cells. Remarkably, no vector DNA
was stably integrated into the iPS cell genome. However, the
reprogramming of adult skin fibroblasts was not reported in the
paper and may be difficult to achieve by transient transfection.
Reprogramming of adult skin fibroblasts is less efficient than
reprogramming of MEFs [6]. The combination of inefficient transient
transfection of adult dermal fibroblasts and inefficient
reprogramming by this method may inhibit the practical application
of this protocol to adult cells.
Recently, Sommner et al. [34] and Carey et al. [35]
reported the derivation of iPS cells from adult skin fibroblasts
using polycistronic lentiviral vectors. Both groups demonstrated
that individual clones of iPS cells were capable of
forming tissues derived from all three germ layers after injection
into immunocompromised mice and that high-level chimeras
were formed after injection of iPS cells into wild-type
murine blastocysts. However, in neither case was the polycistronic
vector deleted from the genome. Also, insertion sites
were not cloned, sequenced, or mapped to specific genomic
locations. These steps are important for clinical application of
this technology. We have demonstrated that our ‘‘hit and run’’
vector is capable of reliably reprogramming adult skin fibroblasts
and that the vector can be efficiently deleted from the
genome. In addition, we have cloned, sequenced, and mapped
the small sequences remaining after vector deletion and demonstrated
that these remnant sequences do not interrupt exons,
promoters, or known regulatory elements.

Результаты (русский) 1:

Прямые, перепрограммирование взрослых соматические клетки pluripotentСтволовые клетки имеет огромный терапевтический потенциал. Мы недавнопоказали что взрослые кожи фибробластов от нашего гуманизированныеСерп мыши могут быть перепрограммированы в клетки iPS и чтоСерп мутации могут быть исправлены в эти клетки геновзамена. Исправлен гемопоэтических прародителями, производный отИПК клетки были пересажены в облученных серп мышьполучатели, которые исправлены тяжелой анемии и органа патологиичто характеризует серповидно-клеточной анемии в организме человека [2].Хотя эти результаты заложили основу для аналогичныхподход в организме человека, перепрограммирования векторов, которые мы использовалиранее не могут быть использованы в клетках человека, которые будут в конечном счетеиспользоваться для терапии. Таким образом, мы разработали итестирование одного, полицистронная лентивирусные вектор, который может бытьудалены после перепрограммирования взрослых фибробластов в клетки iPS.Свиные teschovirus-1 2A последовательности что рибосома триггерапропуска были вставлены между человека Oct4, Sox2 и Klf4cDNAs и polycistron был subcloned вниз по течению отEF-1a промоутер в ГРЕХ лентивирусные вектор, содержащий loxPсайт в усеченную 30 ЛТР. 2A последовательности пептида CHYSELсигнал рибосома пропустить образование пептидных связейГлицин и пролина во время перевода и продуктыOct4 и Sox2 белки, содержащие дополнительные 21 аминокислотв Термини карбоксильную (вспомогательной информации рис. 1). СинглПроЛайн также добавляется к амино Термини Sox2 иKlf4. Наши результаты показывают, что Oct4 и Sox2, Klf4 сЭти изменения терминала в полной мере способны перепрограммированияфибробластов кожи взрослых в клетки iPS. Обе временные Creвыражение из плазмиды и адено/Cre инфекции iPSклетки эффективно исключить ОСК полицистронная lentival вектора.Важно отметить, что после удаления ОСК и инъекции в кивок /SCIDIL2R / мышей, индивидуальные клоны клеток iPS были способныформирования тканей, полученных от всех трех зародышевых слоев.Эти ткани включены энтодермы производные эпителия кишечника,мерцательного эпителия дыхательных путей и поджелудочной железы ацинусов, мезодермы-производные скелетных мышц, хрящей и костей и эктодермы-производных нервной ткани и кожи как стратифицированной плоскоклеточныйэпителий. Кроме того после удаления lenti/ОСК, высокого уровняэмбрионов химерных и взрослых были получены при клетки iPSвводили в одичал тип бластоцисты.Группа Яманака недавно сообщила, что аналогичные полицистроннаявектор, содержащий ног и рта болезни вирус 2A пептидыможно перепрограммировать MEFs для клеток iPS [17]. В этих экспериментахOKS полицистронная плазмида была временно cotransfected с c -Myc плазмида в MEFs и эти эмбриональные клетки были успешноперенесены в клетки iPS. Удивительно нет дна векторастабильно была интегрирована в геном клетки iPS. ОднакоПерепрограммирование фибробластов кожи взрослых не сообщалось вБумага и может быть трудно достичь, переходных transfection.Перепрограммирование фибробластов кожи взрослых является менее эффективным, чемПерепрограммирование MEFs [6]. Сочетание неэффективных переходныеТрансфекция взрослых фибробластов дермы и неэффективныеПерепрограммирование этим методом может препятствовать практическому применениюнастоящего протокола для взрослых клеток.Недавно Sommner et al. [34] и Carey et al. [35]сообщили дифференцирование iPS клеток из фибробластов кожи взрослыхс помощью полицистронная лентивирусные векторы. Обе группы показаличто отдельные клоны клеток iPS были способныФормирование тканей, полученных от всех трех зародышевых после инъекцииослабленным иммунитетом мышей и что высокого уровня химербыли сформированы после инъекции клеток iPS в одичал типмышиных бластоцисты. Однако в обоих случаях был полицистроннаявектор, удалены из генома. Кроме того вставки сайтыбыли не клонируются, виртуализации или сопоставлены специфические геномныеместа. Эти шаги являются важными для клинического примененияЭта технология. Мы показали, что наши '' хит и запустить ''вектор способен надежно перепрограммирования фибробластов кожи взрослыхи что вектор может быть эффективно удаляются изгеном. Кроме того мы клонирован, виртуализации и сопоставленымалые последовательности, оставшихся после удаления вектора и продемонстрировалчто эти последовательности обмылка не прерывайте экзонов,промоутеры, или известных регуляторных элементов.

Результаты (русский) 2:

Прямое перепрограммирование взрослых соматических клеток в плюрипотентные
стволовые клетки обладает огромным терапевтическим потенциалом. Недавно мы
показали , что взрослые фибробласты кожи от наших гуманизированных
серпа мышей могут быть перепрограммированы в плюрипотентных клетках , и что
серп мутация может быть скорректировано в этих клетках с помощью генной
замены. Кроветворных клетки - предшественники , полученные из исправленных
плюрипотентных клеток были пересажены в облученных серповидно мыши
получателей, которые исправил тяжелую анемию и органной патологии ,
которые характеризуют серповидно - клеточная анемия у человека [2].
Хотя эти результаты послужили основой для подобного
подхода в организме человека, перепрограммирование векторов что мы использовали
ранее не могут быть использованы в клетках человека , которые в конечном счете
будут использованы для терапии. Поэтому мы разработали и
протестировали сингл полицистронного Lentiviral вектор , который может быть
удален после перепрограммирования взрослых фибробластов в плюрипотентных клеток.
Свиные teschovirus-1 2A последовательности , которые вызывают рибосомы
вприпрыжку были вставлены между человеческим Oct4, Sox2 и Klf4
кДНК, и polycistron было субклонируют вниз по течению от
промотора EF-1a в SIN лентивирусов вектор , содержащий LoxP
участок в усеченном 30 LTR. В CHYSEL последовательности 2А пептидные
сигнал рибосомы , чтобы пропустить образование пептидной связи
между глицином и пролина в процессе перевода и производят
Oct4 и Sox2 белки , содержащие дополнительные 21 аминокислоты
на карбокси - концах (сопроводительную информацию , рис. 1). Один из
пролина также добавляется к амино - концам Sox2 и
Klf4. Наши результаты показывают , что Oct4, Sox2 и Klf4 с
этих терминалов модификаций вполне способны перепрограммировать
фибробластами кожи взрослого в плюрипотентных клеток. Оба переходных процессов Cre
экспрессии из плазмиды и Адено / Cre инфекции плюрипотентных
клеток эффективно удалили OSK полицистронного lentival вектор.
Важно отметить, что после того, как OSK удаления и инъекции в NOD /
SCIDIL2R? /? мышей, индивидуальные клоны плюрипотентных клеток способны
образовывать ткани , полученные из всех трех зародышевых листков.
Эти ткани включены эндодермы кишечного эпителия,
мерцательный эпителии дыхательных и панкреатического трубочек, mesoderm-
производный скелетных мышц, хряща и кости, а также ectoderm-
полученные нервной ткани и кожи , как многослойный плоский
эпителий. Кроме того, после того, как Ленти / OSK удаления, высокого уровня
химерных эмбрионов и взрослых были получены , когда клетки плюрипотентных
вводили в бластоцисты дикого типа.
Группа Яманаки недавно сообщила , что аналогичный полицистронная
вектор , содержащий ящур вируса 2А пептиды
может перепрограммировать MEFs в ИСН клетки [17]. В этих экспериментах проводились
полицистронная плазмида ОКС была скоротечно котрансфицированных c-
плазмиды Myc в MEFs, и эти зародышевые клетки успешно
перепрограммировать в плюрипотентных клеток. Удивительно, но не ДНК - вектор
был стабильно интегрирован в геном клетки иПК. Тем не менее,
перепрограммирование взрослых фибробластов кожи не сообщалось в
работе и может быть трудно достичь с помощью временной трансфекции.
Перепрограммирование взрослых фибробластов кожи менее эффективен , чем
перепрограммирования MEFs [6]. Сочетание неэффективного переходного
трансфекции взрослых фибробластов кожи и неэффективного
перепрограммирования этим методом может ингибировать практическое применение
этого протокола к клеток взрослого организма . В
последнее время , Sommner и др. [34] и Кэри и др. [35]
сообщили о выводе плюрипотентных клеток из фибробластов кожи взрослых с
использованием полицистронные лентивирусов векторов. Обе группы показали ,
что индивидуальные клоны плюрипотентных клеток способны
формирования тканей , полученных из всех трех зародышевых листков после инъекции
Into иммунодефицитом мышей и что химеры на высоком уровне
были сформированы после инъекции плюрипотентных клеток в дикого типа
мышиных бластоцист. Тем не менее, ни в том, ни в другом случае был полицистронная
вектор удален из генома. Кроме того , вставки сайты
не были клонированы, секвенированы, или отображены в конкретных геномных
местах. Эти шаги имеют важное значение для клинического применения
данной технологии. Мы показали , что наш '' хит и запустить ''
вектор способен надежно перепрограммировать фибробласты кожи взрослого
и что вектор может быть эффективно удалены из
генома. Кроме того, мы клонирован, секвенирован и сопоставляется
малые последовательности , оставшиеся после удаления вектора и показали ,
что эти остаточные последовательности не прерывают экзоны,
промоторы, или известные регуляторные элементы.